引言：离子交换中的“温柔派”
在离子交换色谱的家族中，强阴离子交换柱（SAX）以其“始终带正电”的特性广为人知。然而，并非所有的分离任务都需要这般“强硬”的保留。对于某些弱酸性化合物，SAX柱的强保留反而成为回收率低、残留高的“罪魁祸首”。
这时，我们需要一位“温和大使”——WAX色谱柱。
WAX，全称为弱阴离子交换柱（Weak Anion
Exchange），其官能团为叔胺基（如二乙氨乙基，DEAE），是一种弱碱性阴离子交换剂。与季铵基的“永电离”不同，叔胺基的质子化程度随pH变化而变化，这一特性赋予了WAX柱独特的“可调性”和更为温和的保留行为。
近年来，随着寡核苷酸药物、单克隆抗体等新型生物制剂的快速发展，WAX柱在生物大分子分析领域展现出越来越重要的价值。本文将系统解析WAX色谱柱的化学本质、分离原理、典型应用以及使用中的关键技术要点。
一、WAX是什么？——从“叔胺”的结构说起
1.1 核心定义
WAX色谱柱，是指在色谱填料表面键合了叔胺基官能团的弱阴离子交换柱。其典型的化学结构为：
基质 — (CH₂) —
N⁺H(CH₂CH₃)₂
在色谱柱中，常以盐的形式（如Cl⁻）存在以维持电中性。叔胺基的pKa通常在8-10之间，这是它与强阴离子交换剂*根本的区别。
1.2 WAX vs SAX：“强”与“弱”的本质区别
理解WAX与SAX的区别，是掌握这一技术的核心：
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对比维度
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WAX（弱阴离子交换）
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SAX（强阴离子交换）
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官能团
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叔胺基（-NR₂H⁺）
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季铵基（-NR₃⁺）
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pKa
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约8-10（弱碱性）
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>11（强碱性）
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电荷状态
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随pH变化：低pH时带正电，高pH时趋向中性
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pH 2-12范围内恒定带正电
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保留行为
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对目标物的保留较弱，更“温和”
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对目标物的保留较强
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回收率
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通常更高，残留风险低
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某些弱酸可能回收率偏低
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选择性调节
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可通过pH灵活调控
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选择性相对固定
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适用对象
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弱酸性化合物、某些蛋白质和寡核苷酸
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强酸、常规阴离子
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正如“强”不代表“更好”，“弱”也不代表“更差”。WAX的“温和”特性使其在某些特定场景中反而具有独特优势。
1.3 “弱”的实际意义：可调节的保留
WAX的“弱”体现在两个方面：
**，质子化程度可调：在pH低于pKa时（如pH 7），叔胺基被质子化，带正电，能够保留阴离子；当pH高于pKa时（如pH 9以上），叔胺基趋向中性，离子交换作用显著减弱。这意味着用户可以通过调节缓冲液的pH值来控制保留强度，为方法开发提供了更大的灵活性。
第二，固有结合强度较弱：即使在*适pH条件下，叔胺基与阴离子的静电作用强度也低于季铵基。这种“弱结合”带来的好处是目标物更容易被洗脱，回收率更高，残留效应更低。
二、分离原理：pH调控的“接力赛”
2.1 核心机制：静电作用的pH依赖性
WAX柱遵循阴离子交换色谱的基本原理：固定相带正电，与带负电的样品阴离子发生静电相互作用而被保留。
关键在于，这种“带正电”的状态是有条件的、可调节的：
· 酸性到中性条件（pH 2-7）：叔胺基完全质子化，WAX柱表现出强阴离子交换剂的行为，有效保留阴离子。
· 弱碱性条件（pH 7-10）：叔胺基部分质子化，保留能力随pH升高而下降。
· 强碱性条件（pH >10）：叔胺基接近中性状态，离子交换作用基本消失。
这一特性赋予WAX柱一个SAX柱不具备的能力：可以用pH梯度代替盐梯度进行洗脱。
2.2 影响保留的关键参数
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参数
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对保留的影响
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典型调节方向
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流动相pH
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直接影响WAX官能团和待测物的电离状态
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pH < pKa时保留增强；pH > pKa时保留减弱
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离子强度（盐浓度）
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抗衡离子（如Cl⁻）与样品竞争结合位点
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盐浓度↑ → 保留时间↓
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有机相比例
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影响静电作用的介电环境
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高有机相可增强静电作用（间接影响）
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抗衡离子类型
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不同阴离子与固定相的亲和力不同
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洗脱能力顺序：ClO₄⁻ > I⁻ > NO₃⁻ > Cl⁻
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2.3 “温和”的优势体现在哪？
WAX柱的“温和”特性，在以下场景中展现出独特价值：
优势一：高回收率
对于弱酸性化合物（如寡核苷酸、某些蛋白质），SAX柱的强保留可能导致目标物在柱上发生不可逆吸附，回收率偏低。WAX柱的弱结合特性显著降低了这种风险，回收率通常可达90%以上。
优势二：低残留效应
在使用SAX柱时，分析人员常遇到“进样一次、残留三针”的困扰。WAX柱因其温和的保留特性，残留风险显著降低，更适合痕量分析和质谱联用。
优势三：高有机相兼容性
在高比例有机相的洗脱条件下，SAX固定相可能出现膨胀导致的柱压急剧升高。研究显示，WAX色谱柱在低离子强度流动相中表现出更高的渗透性和更低的背压，因此更适合与高含量有机溶剂配合使用。这一特点使其能够与质谱检测器更好地联用。
三、WAX色谱柱的类型与选择
3.1 基质类型
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基质
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优点
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缺点
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适用场景
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硅胶基质WAX
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柱效高、机械强度好
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pH范围窄（2-8），耐碱性弱
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小分子弱酸分析、常规离子交换
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聚合物基质WAX
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pH范围宽（1-14），化学稳定性优异
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柱效略低于硅胶，成本较高
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生物大分子（蛋白质、寡核苷酸）分析
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在生物制药领域，聚合物基质WAX柱因其宽pH耐受性和优异的生物相容性而成为主流选择。
3.2 典型固定相：DEAE是*常见的WAX官能团
DEAE（二乙氨乙基）是*经典的WAX官能团，在USP分类中对应L23。常见的DEAE型WAX柱包括：
·
TSKgel DEAE-5PW（东曹）：甲基丙烯酸酯基质，适用于蛋白质、寡核苷酸分析
·
Gen-Pak FAX（沃特世）：2.5 µm无孔聚合物颗粒，专为寡核苷酸和蛋白质分析设计
3.3 如何选择WAX柱？
面对不同的分析任务，建议按以下逻辑进行选型：
待分析物性质？
│
├── 小分子弱酸（有机酸、酚类等）
│
└── 硅胶基质WAX柱（柱效高、分辨率好）
│
├── 蛋白质（pI低于流动相pH）
│
└── 聚合物基质WAX柱（宽pH、生物相容性好）
│
├── 寡核苷酸（合成DNA/RNA、反义寡核苷酸）
│
└── 聚合物基质WAX柱，推荐无孔颗粒型（如Gen-Pak FAX，TSKgel DNA-NPR）
│
└── 高有机相洗脱条件
└── 选择渗透性好的WAX柱（聚合物型为佳）
四、典型应用领域
4.1 寡核苷酸分析（快速增长的核心应用）
这是WAX柱近年来*重要、增长*快的应用领域。
合成寡核苷酸（如反义寡核苷酸、siRNA、mRNA疫苗相关产品）的纯度分析是质量控制的关键环节。磷酸骨架使寡核苷酸带负电荷，每增加一个核苷酸就多一个负电荷——这使得AEX理论上能够根据链长差异实现分离。
Waters的一项研究表明，使用Gen-Pak FAX弱阴离子交换柱分离15~35 mer的寡核苷酸dT ladder时，有效峰容量达到98，显著优于某些强阴离子交换柱。更重要的是，研究者发现了一种含75%甲醇的特殊洗脱条件，能够实现硫代磷酸寡核苷酸杂质的很好分离——这是离子对反相色谱法无法实现的。正如研究者所总结的：
“弱AEX色谱柱*显著的优势是它能够兼容高有机相含量、低盐含量的流动相进行洗脱。这些**的AEX条件避免了不必要的疏水、极性/亲水和氢键相互作用，并尽可能地利用单一的离子/静电分离机制。”
4.2 蛋白质电荷异质体分析
单克隆抗体等**性蛋白的电荷异质体分析是IEX色谱的传统强项。对于等电点（pI）较低的单抗（如那他珠单抗，pI约7.8），WAX柱是理想的选择。
研究发现，Gen-Pak FAX色谱柱在分离中性pI单抗的电荷异构体时，表现出主峰更尖锐、分辨率更高的特点，同时柱压仅为SAX柱的三分之一。
4.3 弱酸性化合物分析
在食品、环境、药物分析中，WAX柱常用于富集和分离弱酸性化合物，如：
· 有机酸（甲酸、乙酸、柠檬酸等）
· 酚类化合物
· 某些药物代谢物
在固相萃取（SPE）领域，WAX小柱也广泛用于从水样或生物体液中提取酸性目标物。
4.4 与质谱联用的特殊优势
WAX柱能够兼容高比例有机相（如75%甲醇）洗脱的特性，使其在LC-MS联用中具有天然优势。高有机相可提升电喷雾离子化的效率，改善质谱信号响应。这对于寡核苷酸等对离子化条件敏感的化合物尤为重要。
五、常见问题与解决方案
WAX色谱柱在使用中可能遇到的问题与SAX柱有相似之处，但也有其独特的特点。
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问题现象
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可能原因
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解决方案
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保留时间漂移
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1. 色谱柱未充分平衡
2. 流动相pH变化
3. 柱温波动
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1. 新柱需平衡30-50倍柱体积
2. 使用高精度pH计配制缓冲液
3. 使用柱温箱
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保留时间过弱
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1. 流动相pH过高
2. 盐浓度过高
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1. 检查并降低pH至pKa以下（如pH 7）
2. 降低起始盐浓度
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保留时间过强
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1. 流动相pH过低
2. 洗脱梯度不当
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1. 适当提高pH（但需注意目标物稳定性）
2. 增加盐梯度斜率或提高终点浓度
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峰形拖尾
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1. 次级相互作用
2. 样品过载
3. 柱头污染
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1. 检查流动相添加剂
2. 减少进样量
3. 执行在位清洗
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柱压异常升高
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1. 筛板堵塞
2. 盐析
3. 聚合物基质溶胀
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1. 使用保护柱
2. 确保含盐流动相使用后有充分过渡
3. 使用高比例有机相冲洗再生
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回收率低（寡核苷酸样品）
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1. 固定相保留过强
2. 洗脱强度不足
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1. 确认使用的是WAX而非SAX柱
2. 提高洗脱盐浓度或有机相比例
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基线不稳定
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1. 缓冲液新鲜度不足
2. 检测器污染
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1. 使用新鲜配制的缓冲液
2. 清洗检测器流通池
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5.1 特别提醒：WAX柱的pH平衡艺术
WAX柱的使用精髓在于pH的精准控制。由于叔胺基的质子化程度直接决定保留强度，建议：
· 初始筛选：从pH 6.5-7.5开始，此为WAX柱*常见工作区间
· 保留不足时降低pH：pH每降低0.5，保留通常增强
· 保留过强时升高pH：但需注意目标物在碱性条件下的稳定性
· pH一致性：确保样品溶液pH与起始流动相pH一致，避免“pH冲击”
5.2 关于“聚合物溶胀”问题的处理
聚合物基质WAX柱在低离子强度流动相中可能出现溶胀现象，表现为柱压升高、峰形变差。解决策略包括：
1.
确保流动相中含有足够浓度的盐（至少20 mM缓冲盐）
2.
逐步过渡——避免从高盐直接切换到纯水
3.
若已发生溶胀，用含高盐的流动相（如500 mM NaCl）低流速冲洗再生
5.3 样品溶剂的重要性
与所有IEX色谱一样，样品溶剂的选择直接影响峰形和回收率：
· *佳实践：样品溶剂组成与起始流动相匹配（pH和盐浓度一致）
· 避免：使用纯水或与起始流动相pH差异>1单位的溶剂
· 高有机相洗脱的特殊情况：若采用高有机相洗脱方法，样品溶剂也应含有相应比例的有机相以确保溶解度
六、维护与再生指南
6.1 日常维护要点
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维护项目
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具体操作
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频率
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流动相pH控制
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控制在pKa范围内（通常5-9），使用新鲜缓冲液
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每次配制
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缓冲液使用
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确保盐浓度≥20 mM，防止溶胀
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始终
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使用保护柱
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强烈推荐加装同类型保护柱
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始终
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每日冲洗
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分析结束后用含盐流动相冲洗20倍柱体积，再用保存溶剂过渡
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每日
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样品过滤
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所有样品必须经0.22 μm或0.45 μm滤膜过滤
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每次进样前
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盐的处理
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切忌含盐流动相后直接用纯有机相冲洗，应用高比例水相过渡
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每次使用后
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6.2 再生步骤
当色谱柱出现柱效下降或峰形变差时，可尝试以下清洗程序：
方案一：常规再生（去除盐和常规污染物）
1.
用20倍柱体积高盐缓冲液（如500 mM NaCl + 20
mM缓冲液洗脱）冲洗
2.
再用5倍柱体积低盐起始缓冲液平衡
方案二：强化再生（严重污染时）
1.
按顺序冲洗，每种溶剂20倍柱体积：
o
水
o
0.1 M NaOH（去除蛋白和疏水杂质，注意停留时间不宜过长）
o
水
o
0.5 M NaCl
o
水
o
高比例乙腈或异丙醇（去除疏水污染物）
2.
用起始流动相充分平衡（>30倍柱体积）
注意：清洗时应避免溶剂的pH超出色谱柱允许范围（硅胶基质2-8，聚合物基质1-14）。
6.3 保存方法
· 短期（1-3天）：保存在不含盐的起始缓冲液或与保存溶剂比例相同的过渡溶剂中
· 长期（超过3天）：
o
硅胶基质WAX：保存在20%甲醇水溶液或乙腈/水（50/50） 中
o
聚合物基质WAX：保存在20%甲醇或0.1 M NaCl中以防止干燥和微生物滋生
· **禁忌：将含缓冲盐的流动相留在柱内过夜；色谱柱干涸
结语
WAX（弱阴离子交换）色谱柱是离子交换家族中一位“懂得克制”的成员。它不与SAX比“保留强度”，也不与反相比“通用性”，而是在弱酸性化合物和生物大分子分析这一特定战场上，展现出了不可替代的价值。
WAX柱的核心优势可以概括为一个关键词：温和。这一温和体现在三个方面：
1. 可调的保留：通过pH调控，用户可以根据需要“伸缩”保留强度
2. 高回收率：弱结合意味着易洗脱，尤其适合珍贵样品的分析
3. 低残留效应：为痕量分析和质谱联用提供了更干净的背景
随着寡核苷酸药物、基因**等新兴领域的发展，WAX柱的应用前景将更加广阔。正如研究者所展望的，通过开发全新的分离条件，WAX柱“能够实现对寡核苷酸杂质分离的出众选择性”。
当您面对寡核苷酸纯度分析的挑战、弱酸性化合物回收率低的困扰，或需要一种能够与高有机相洗脱兼容的离子交换方法时，请想起WAX柱——那位离子交换世界中的“温和大使”。
WAX柱使用五句要诀：
1.
叔胺基，pKa八到十，pH一调保留变
2.
弱酸弱碱它通吃，回收率高残留低
3.
寡核苷酸是新宠，高有机相也不惧
4.
DEAE是经典名，无孔颗粒高压低
5.
盐溶液后莫干涸，定期清洗寿命延
