食品和饲料样品的水解

3.1 简介

食品和饲料由包含生长和营养所必需氨基酸的化合物组成。分析氨基酸含量对于确保合适的营养非常重要。但是，这些产品是通过批量工艺生产的。与药物生产一样，批量工艺在生产运行过程中，产出可能会有所不同。因此，必须考虑代表性样品的构成因素。通常需要采用二次抽样策略。这些产品的氨基酸分析需要采用多种方法，以便正确分析样品的总蛋白质组成。由于食品和饲料是批量生产的，且其中包含非蛋白质成分，因此建议使用液相水解方法。

注：含硫氨基酸 - 半胱氨酸和蛋氨酸，以及色氨酸在标准酸水解中不稳定。可以采用替代方法来有效分析这些氨基酸。

本节介绍了三种不同的水解方法：

• 酸水解 - 测定总蛋白质含量和组成

• 过甲酸氧化 - 测量含硫氨基酸 - 半胱氨酸和蛋氨酸

• 碱水解 - 评估色氨酸回收率

3.2 食品和饲料的酸水解

分析结合在蛋白质中的氨基酸时，必须破坏肽键，释放氨基酸以进行分析（图1）。对于要水解的饲料蛋白质样品，应考虑样品材料的pH值和存在的固体。如之前的小节所述，水解的速率或程度因蛋白质中存在的氨基酸而异。对于食品材料中结合的蛋白质而言尤其如此。和其他水解方法一样，选择参数的必须基于严谨实验的结果。

在饲料分析中，必须牢记样品制备的三个因素：

1. 样品处理

2. 水解的样品量

3. 用于水解的酸体积

3.2.1 样品处理

饲料谷物及类似的样品通常不均匀。为了使这类样品尽可能地保持均匀，应将样品研磨成细粉。对于高脂样品，可以在最终研磨前通过标准程序进行脱脂处理。细粉可有效水解饲料蛋白质。AOAC方法（4.1.11，994.12b，J.AOAC Int.88，2005，饲料的氨基酸分析）中要求将测试样品研磨至能够通过0.25 mm或60目筛（粒径250 µm）的程度。

3.2.2 样品量

对于饲料的氨基酸分析，AOAC方法建议使用以下计算来确定饲料分析中使用的样品量。

要计算要使用的待测样品的大致量，公式如下：

Ws = 1000/Ns

其中，Ns = 待测样品的氮含量(%)，Ws = 与10 mg氮含量相当的待测材料的重量(mg)。

一般来说，对于每个分析的样品，所用材料的含量范围约在100–1000 mg内。

3.2.3 酸体积

如前所述，有效水解蛋白质样品需要大量过量的酸。饲料也不例外。但是，与第2.1.2节中讨论的过量100倍不同，根据AOAC方法994.12中的说明，添加的酸重量与样品重量的比率范围应为50–500倍。由于该范围较大，以及饲料中存在大量非蛋白质颗粒物质，因此要先对范围进行仔细地探索研究，然后才能将范围应用于常规饲料分析。

3.2.4 内标

使用内标(IS)可很好地补偿样品中各氨基酸可能发生的水解。沃特世建议在UPLC上使用正缬氨酸(Nva)作为AccQ•Tag Ultra的内标，在HPLC上使用α-氨基丁酸(AABA)或正亮氨酸作为AccQ•Tag的内标。AOAC方法994.12中推荐使用正亮氨酸作为饲料分析的内标。请谨慎选择内标，确保色谱中氨基酸峰之间可以获得所需的分离度。

3.2.5 AOAC 994.12 - 饲料中的氨基酸

文献报道了多种适用于饲料中氨基酸分析的方法。此处介绍的方法改编自AOAC方法994.12“饲料中的氨基酸”。

3.2.5.1 设备和玻璃器皿：

• 分析天平（可读性：±      0.1 mg）

• 上皿式天平

• 溶剂瓶，50      mL；聚乙烯

• 可使用水解试管、烧瓶

• 可使用消解器、加热罩或水浴

• 过滤器装置，0.22      µm（Millex GS、Millipore均适用）

• pH计，经pH      2.0、4.0和7.0的缓冲液校正

• 回流冷凝器

• 旋转蒸发仪

• 玻璃烧杯（250      mL和1000 mL）

• 锥形瓶(150      mL)

• 圆底蒸发瓶(1000      mL)

• 量筒（100      mL、500 mL和1000 mL）

• 容量瓶(1000      mL)

• 移液管（10      mL和20 mL）

• 烧结玻璃过滤器（孔隙10–15      µm）

• 注射器

3.2.5.2 试剂

• DL-正亮氨酸（晶体）

• 浓盐酸

• 氢氧化钠，30%溶液(30 g/100 mL)

• 苯酚（晶体）

• 硫二甘醇（98%溶液）

• 二水合柠檬酸三钠

• pH缓冲液（pH      2.0、4.0和7.0）

3.2.5.3 溶液制备

柠檬酸钠缓冲液 - pH 2.20

1. 称取19.60      g二水合柠檬酸三钠，放入1000 mL烧杯中。

2. 将其溶于约800      mL水中。

3. 搅拌时，加入10      mL 98%硫二甘醇溶液和15 mL HCl。

4. 将溶液定量转移至1000      mL容量瓶中，用水定容。

5. 使用烧结玻璃过滤器过滤缓冲液。

6. 用HCl或2 M NaOH将pH调节至2.20。

6 M HCl-苯酚溶液

1. 称取1 g苯酚晶体，放入已去皮重的1000 mL烧杯中。

2. 将晶体溶于500      mL水中。搅拌时，缓慢加入500 mL HCl。

盐酸溶液 - 1 M

1. 将约800      mL水倒入1000 mL容量瓶中。

2. 使用移液管加入83.3      mL HCl。

3. 用水定容并充分混合。

盐酸溶液 - 0.1 M

1. 将约800      mL水倒入1000 mL容量瓶中。

2. 使用移液管加入100      mL 1 M HCl。

3. 用水定容并充分混合。

氢氧化钠溶液(2 M NaOH)

1. 称取80.0      g NaOH，放入已去皮重的1000 mL烧杯中。

2. 在烧杯中，将颗粒缓慢溶于约600      mL水中。

3. 冷却溶液并将其定量转移至1000      mL容量瓶中。

4. 用水定容并充分混合。

内标溶液

1. 准确称取195–200      mg DL-正亮氨酸晶体，放入已去皮重的150 mL锥形瓶中。

2. 用100 mL 1 M HCl溶解晶体。

3. 将溶液定量转移至1000      mL容量瓶中，用水定容。

3.2.5.4 水解步骤

1. 准确称取100–1000      mg研磨粉碎的待测样品（精确至0.1 mg；相当于氮含量约10 mg），放入带标记的水解试管中。使用之前小节中所述的计算方法确定要使用的实际样品量。

2. 将50 mL 6 M HCl-苯酚溶液加入已称重的样品中，稍稍搅拌。向溶液中加入2–3块沸石。

3. 在通风橱中，使用平衡至110–120      °C温度的加热器或水浴，回流水解24 h。

4. 将水解试管从加热装置中取出，等待试管冷却至室温。

5. 使用移液管，将20      mL正亮氨酸内标溶液加入各待测溶液中。摇动烧瓶，将溶液混合。

6. 使用烧结玻璃过滤器将水解产物过滤到带标记的1000      mL的圆底蒸发瓶中。

7. 将蒸发瓶连接至旋转蒸发仪，在60      °C下蒸干。

8. 加入约20      mL水清洗，然后重复蒸发。重复清洗和蒸发步骤两次。

9. 从蒸发仪中取出蒸发瓶。

10. 将50 mL柠檬酸钠缓冲液加入蒸发后的水解产物中，充分混合，然后转移至带标记的50      mL聚乙烯瓶中。

11. 现在可对样品进行衍生化处理。

3.3 使用过甲酸氧化法测定半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸

半胱氨酸和蛋氨酸是饲料材料分析中的关键氨基酸；两者都可限制食用饲料动物的生长。由于标准酸水解条件不适用于这两种特定氨基酸，因此通常替代使用过甲酸进行氧化。该方法可将半胱氨酸和胱氨酸转化为三聚氰酸，将蛋氨酸转化为蛋氨酸砜（图3）。然后可对样品进行有效的酸水解和衍生化处理。

文献中报道了多种形式的过甲酸氧化。尽管总体过程相似，但具体情况有所不同。本指南中介绍了可用作可能起点的两种流程。第一种方法来自AOAC 994.12。第二种方法基于MacDonald等人(1985)的报道，为其方法的替代方法。在选择具体方法之前，必须仔细地评估和优化。

3.3.1 过甲酸氧化，方法1，AOAC 994.12

3.3.1.1 设备和玻璃器皿

• 分析天平（可读性：±      0.1 mg）

• 上皿式天平

• 溶剂瓶，50      mL；聚乙烯

• 可使用水解试管、烧瓶

• 可使用消解器、加热罩或水浴

• 过滤器装置，0.22      µm（Millex GS、Millipore均适用）

• pH计，经pH      2.0、4.0和7.0的缓冲液校正

• 回流冷凝器

• 旋转蒸发仪

• 玻璃烧杯（250      mL和1000 mL）

• 锥形瓶(150      mL)

• 圆底蒸发瓶(1000      mL)

• 量筒（100      mL、500 mL和1000 mL）

• 容量瓶(1000      mL)

• 移液管（10      mL和20 mL）

• 烧结玻璃过滤器（孔隙10–15      µm）

• 冰浴

• 注射器

3.3.1.2 试剂

• 甲酸(88%)

• 过氧化氢(30%)

• 焦亚硫酸钠

• DL-正亮氨酸（晶体）

• 浓盐酸

• 氢氧化钠，30%溶液(30 g/100 mL)

• 苯酚（晶体）

• 硫二甘醇（98%溶液）

• 二水合柠檬酸三钠

• pH缓冲液（pH      2.0、4.0和7.0）

3.3.1.3 溶液制备

柠檬酸钠缓冲液 - pH 2.20

1. 称取19.60      g二水合柠檬酸三钠，放入1000 mL烧杯中。

2. 将其溶于约800      mL水中。

3. 搅拌时，加入10      mL 98%硫二甘醇溶液和15 mL HCl。

4. 将溶液定量转移至1000      mL容量瓶中，用水定容。

5. 使用烧结玻璃过滤器过滤缓冲液。

6. 用HCl或2 M NaOH将pH调节至2.20。

6 M HCl-苯酚溶液

1. 称取1 g苯酚晶体，放入已去皮重的1000 mL烧杯中。

2. 将晶体溶于500      mL水中。搅拌时，缓慢加入500 mL HCl。

盐酸溶液 - 1 M

1. 将约800      mL的水倒入1000 mL容量瓶中。

2. 使用移液管加入83.3      mL HCl。

3. 用水定容并充分混合。

盐酸溶液 - 0.1 M

1. 将约800      mL的水倒入1000 mL容量瓶中。

2. 使用移液管加入100      mL 1 M HCl。

3. 用水定容并充分混合。

氢氧化钠溶液(2 M NaOH)

1. 称取80.0      g NaOH，放入已去皮重的1000 mL烧杯中。

2. 在烧杯中，将颗粒缓慢溶于约600      mL水中。

3. 冷却溶液并将其定量转移至1000      mL容量瓶中。

4. 用水定容并充分混合。

内标溶液

1. 准确称取195–200      mg DL-正亮氨酸晶体，放入已去皮重的150 mL锥形瓶中。

2. 用100 mL 1 M HCl溶解晶体。将溶液定量转移至1000 mL容量瓶中，用水定容。

过甲酸试剂

1. 在通风橱中制备。称取25      mg苯酚晶体，放入25 mL试管中。

2. 使用微量移液管加入0.5      mL 30% 过氧化氢。

3. 加入4.5      mL 88%甲酸溶液。

4. 用塞子塞紧试管，在室温下等待混合物静置30      min。

5. 30 min后，将试管置于冰浴中，等待过甲酸混合物冷却15      min。

6. 请在临使用前制备试剂。

3.3.1.4 过甲酸氧化

1. 准确称取100–1000      mg研磨粉碎的待测样品（精确至0.1 mg；相当于氮含量约10 mg），放入带标记的水解试管中。使用上述计算方法确定要使用的实际样品量。

2. 将磁力搅拌器放入各试管中，并将水解试管置于冰浴(0      °C)中。

3. 等待过甲酸和待测样品冷却至少15      min后，向每个水解试管中加入5 mL过甲酸试剂；塞紧所有试管或盖上盖子，搅拌15 min。

4. 将水解试管放回冰浴中，等待样品氧化16 h。

5. 取下玻璃塞，加入约0.84      g焦亚硫酸钠以分解过甲酸。搅拌15 min，释放SO₂。

6. 现在样品可进入酸水解阶段。

3.3.1.5 水解步骤

1. 将50 mL 6 N HCl-苯酚溶液加入已称重的样品中，稍稍搅拌。向溶液中加入2–3块沸石。

2. 在通风橱中，使用平衡至110–120      °C温度的加热器或水浴，回流水解24 h。

3. 将水解试管从加热装置中取出，等待试管冷却至室温。

4. 使用移液管，将20      mL正亮氨酸内标溶液加入各待测溶液中。摇动烧瓶，将溶液混合。

5. 继续下面的步骤(a-d)或(e-g)。

1. 使用烧结玻璃过滤器将水解产物过滤到带标记的1000       mL圆底蒸发瓶中。

2. 将蒸发瓶连接至旋转蒸发仪，并在40       °C真空条件下蒸发至0.5 mL，注：请勿将溶液蒸干。

3. 从蒸发仪中取出蒸发瓶。

4. 将50       mL柠檬酸钠缓冲液加入蒸发后的水解产物中，充分混合，然后转移至带标记的50       mL聚乙烯瓶中。

5. 使用烧结玻璃过滤器将水解产物过滤到250       mL真空烧瓶中，然后将滤液转移到250 mL烧杯中。

6. 将烧杯置于冰浴中。

7. 在搅拌的同时，使用约40       mL 7.5 M NaOH部分中和水解产物。（注：温度不得超过40       °C。）使用2 M NaOH将pH调节至2.20。

     6.现在可对样品进行衍生化处理。

3.3.2 基于MacDonald等人(1985)报道的方法，进行胱氨酸和蛋氨酸的过甲酸氧化和酸水解（方法2）

注：文献中报道了许多有关该分析的不同参考资料，其中关于过甲酸和溴化氢的含量或蒸发温度未达成一致。更改含量和/或温度将影响步骤7中的蒸发时间。

3.3.2.1 材料

• 25 × 150 mm带盖试管

• 冰和冰浴

• 移液管

• 真空蒸发仪

• 洁净的氮气源

• 恒温箱或加热器

• 玻璃量具

• 过甲酸

• 过氧化氢

• 甲酸

• 超纯水

• HBr溶液，48%（重量比）

3.3.2.2 过甲酸试剂

1. 将1体积的30%过氧化氢加入9体积的88%甲酸中。

2. 将混合物静置1 h，频繁摇动。

3. 将混合物置于冰浴中30      min，然后立即使用。

3.3.2.3 步骤

1. 称取相当于约20      mg蛋白质（精确至mg）的样品，放入25 × 150 mm试管中。

2. 将样品置于冰浴中30      min。

3. 向样品中加入10      mL冷过甲酸，轻轻摇动，然后使用Teflon垫片盖密封。

4. 将样品（仍处于大量冰中）置于冰箱中(0      °C)冷藏过夜(16 h)。

5. 16 h后，将样品仍保存在0 °C条件下，加入3滴辛醇，然后加入3 mL冷却的48% HBr，缓慢摇动样品。请在通风橱中完成该步骤。将样品在0 °C下静置30 min。

6. 使用真空蒸发仪在37      °C下将样品蒸干。该过程需要1–2 h。

7. 向试管中加入5 mL的6 N HCl。使用氮气吹扫30 s，然后立即封盖。

8. 将样品置于110      °C恒温箱中加热24 h。

9. 将样品从恒温箱中取出，等待样品冷却。

10. 加入10      mL工作内标(5.0 µmol/mL)，并充分混匀。注：应计算所用内标的实际浓度，以使进样至仪器的样品量相同。

11. 将样品定量转移至250      mL容量瓶中，用HPLC级水冲洗样品试管，并用冲洗液定容。

12. 使用0.45      µm样品过滤器过滤步骤12中的样品约1 mL。如果没有立即进行衍生化处理，请将加盖的样品储存于冰箱中。注：离心可代替该过滤步骤。离心以产生澄清的上清液。

3.4 通过碱水解分析饲料中的色氨酸

在标准酸水解条件下，色氨酸(Trp)不稳定，无法进行有效分析。因此，将碱水解用作饲料中该氨基酸释放和分析的替代方法。此方法使用4.2 M NaOH水解蛋白质。它的一个优势在于，完成后无需进行衍生化步骤。只需进行UV检测(280 nm)的仪器分析即可。

此处介绍的步骤改编自AOAC方法988.15“食品以及食品和饲料成分中的色氨酸“。

3.4.1 设备和材料

• 改良微量凯氏烧瓶（Kjeldahl      flask，可从Ace Glass, Inc.订购）- 25 mL微量凯氏烧瓶，内径12 mm，颈长15 cm。颈部收缩至内径约6 mm，在烧瓶球部上方5 cm。

• 真空泵

• 膜式过滤器和0.45      µm过滤器

• 干冰

• 水浴

• 水浴用乙醇

• 移液管和玻璃器皿

• pH计

3.4.2 试剂

• 经Milli-Q系统(Millipore Corp.)纯化的水，或同等级水

• 4.2 M NaOH

• 1-辛醇

• pH 4.25柠檬酸钠缓冲溶液

• HCl

• 色氨酸标准品溶液

• 储备液 -       1 mg/mL。将250 mg L-色氨酸溶于100 mL水中（其中添加有六滴HCl）中。用水稀释至250 mL。

• 工作溶液I -       0.1 mg/mL。用水将10 mL储备液稀释至100 mL。

• 工作溶液II       - 0.04 mg/mL。用水将4       mL储备液稀释至100 mL。

• 不使用时，请冷藏标准品溶液。请每月制备新鲜溶液。

3.4.3 制备待测样品

1. 在配备1 mm筛网的离心式磨机中研磨实验室样品；充分混合。

2. 称取包含100      mg蛋白质的待测样品，放入改良微量凯氏烧瓶中。

3. 对于脂质含量      > 5%的待测样品：

1. 在烧瓶中，将10       mL石油醚加到已称重的待测样品中。

2. 轻轻摇动混合，并超声处理20       min。静置。必要时离心。

3. 尽可能多地吸出石油醚，小心地避免吸出任何固体。

4. 在温和的氮气流下蒸发剩余的石油醚。继续进行水解。

4. 对于脂质含量      < 5%的待测样品：继续进行水解。

3.4.4 碱水解步骤

1. 通过氮气鼓泡10      min，从4.2 M NaOH中除去气泡。

2. 将10 mL排除气泡的4.2 M NaOH加入各烧瓶中。

3. 加入三滴1-辛醇。

4. 立即在干冰/乙醇浴中冷冻处理后的溶液。然后从干冰/乙醇浴中取出烧瓶并且抽真空至10 mm。

5. 关闭真空并密封烧瓶。

6. 将密封的烧瓶置于室温下装有水的烧杯中，直至待测溶液融化。

7. 将烧瓶置于110      °C恒温箱中加热20 h。

8. 等待烧瓶冷却至室温。

9. 用1 mL pH 4.25的柠檬酸钠缓冲溶液冲洗烧瓶颈部，将冲洗液收集到烧杯中。

10. 将水解产物定量转移至同一50      mL烧杯中，用两份pH 4.25的柠檬酸钠缓冲液冲洗烧瓶。

11. 用3.5 mL HCl中和溶液并用力搅拌。将pH调节至4.25 ± 0.05。

12. 将溶液定量转移至25      mL容量瓶中，用水定容。

13. 将溶液倒入40      mL离心管中，并在1150 G下离心20 min。

14. 使用玻璃纤维滤纸(Whatman      GF/A)过滤上清液。

15. 将滤液转移到离心管中，并在23,000      G下离心10 min。

注：此时可以取上清液等分试样进行UV (289 nm)分析，无需衍生化处理。